舞台は1936年。プリンストン大学で教鞭を執る高名な考古学者インディアナ・ジョーンズ教授(インディ)には、世界中の宝物を探し発見するというトレジャーハンターとしての顔があった。ある日、陸軍諜報部よりインディの下にナチス・ドイツがタニスの遺跡を発見して聖櫃(アーク)の発掘に着手したという情報が舞い込む。また情報部が傍受したドイツ軍の電報によれば、聖櫃の在り処を示す重大な手がかりラーの杖飾りはインディの恩師であるアブナー・レイヴンウッド教授の手にあるという。何としてでもナチスより先に聖櫃を手に入れろとの依頼を受け、インディは聖櫃の争奪戦に臨む。
1935年、上海。あるナイトクラブで殺されかけた考古学者にして冒険家のインディはクラブの歌姫ウィリー、現地の少年ショーティを連れて逃げだす。3人が乗った飛行機は墜落し、インドの山奥に不時着。3人は寂れた村にたどり着くが、そこでその長老から神の使いだと誤解される。村は謎の邪教集団に襲撃され、宝の石を奪われ、子どもたちを奪われたという。子どもたちの救出を依頼されたインディは教団の宮殿へと向かう。
舞台は1938年。冒険家として、また考古学教授として多忙な日々を過ごすインディ・ジョーンズに、大富豪ドノヴァンから相談が持ちかけられる。イエス・キリストの聖杯の所在を示す重大な遺物を手に入れたが、調査隊の隊長が行方不明になり、それを探して欲しいというのだ。 最初は渋っていたインディだったが、その行方不明になった隊長というのが自分の父、ヘンリー・ジョーンズであると聞き、仕方なく依頼を承諾。父が最後に消息を絶ったヴェネツィアに向かった。
1957年、大学で学生たちに考古学を教えているジョーンズ博士(ハリソン・フォード)は、超常現象的なパワーが宿っているという秘宝“クリスタル・スカル”を求め、相棒の若者マット・ウィリアムズ(シャイア・ラブーフ)とともに再び冒険の旅へと出る。しかし、インディたちの前に、秘宝を付け狙うロシア軍が立ちはだかり…。
人間の想像を超える力”を持つ謎に満ちた伝説の秘宝を巡り、考古学者にして冒険家のインディが、因縁の宿敵、元ナチスの科学者フォラーと全世界を股にかけて陸・海・空と全方位で争奪戦を繰り広げる!